因為(wéi)對孔徑的共同的安置,共聚集顯微鏡勘探器所供給(gěi)的圖畫對應於一個薄(báo)的光學(xué)切片或是樣(yàng)品的截麵。例如,一個幾毫米(mǐ)厚的樣品在焦平麵處沿z軸降最(zuì)少於微(wēi)米。
共聚集處的光照場通過一個被稱為針(zhēn)孔的孔徑所約束。視場相同也遭到一個針孔的(de)約束,針孔的方位是相關於第一個孔徑與照耀點共軛的像平麵上(shàng)。這種共聚集裝備的(de)成果(guǒ)即是降低了對(duì)散焦(jiāo)光的勘探,然後通過削減(jiǎn)成像容積來添加信噪比。
Marvin Minsky首要規劃了(le)共聚集顯微鏡並在1957年的一份專利中描(miáo)繪(huì)了一個通過移動照耀光束渠(qú)道來完(wán)成的。從樣品發來的調製(zhì)光被送往光(guāng)電管用示(shì)波器調查。光(guāng)照耀及隨後的勘探是通逐點地過移(yí)動渠道來完成的。Minsky的極具自創性的設想終究徹底改變了顯微鏡。
Minsky的專利被通(tōng)過的時分,仍是存在有幾個技能難點。因為約束孔徑,他的(de)體係需求非常強的光源。鑒於由針孔(kǒng)損失的光強,在其時激光並不存在,而且也沒有別的滿足強的光源來激起熒光。在那時(shí)分Minsky運用的是長期耐久的示(shì)波器做觀測,因而沒有辦法照實記載圖畫。致使別的發(fā)明者對這一特別的顯微(wēi)鏡做(zuò)進一步(bù)的發展(zhǎn)變成對一般研究者的有用東西。
發展激烈的單色光(guāng)源—激光—處理了照耀的疑問。計算(suàn)機裝備了數字化(huà)儀以後,使記載(zǎi)和實踐圖畫變得垂手可得。如今,如(rú)今掃描共焦運用激光或結合激(jī)光(guāng)作為照耀光源。這種掃描是通過精確操控振鏡以光柵運動的方法,用最(zuì)小光斑(bān)掃過(guò)視場,就像通過電腦操(cāo)控電視相同。從樣品(pǐn)散射或反射的熒光信號被發送到光電倍增管(PMT),這是一次構成圖畫在屏幕上的一個點(像元素、像素點)。
盡管Minsky羅列(liè)了共聚集的很(hěn)多長處,或許最主要的功用即是掃描共聚集顯微鏡能(néng)夠對樣品(pǐn)進行光學(xué)截麵成(chéng)像。傳統上,通過(guò)固定安排然後細心地將其切片成以便調查和成像的薄層,來獲取細胞或安排的精細結構。這(zhè)個進程(chéng)需求將(jiāng)樣品處死,而且需求研究人員(yuán)花費好幾年時刻去學(xué)習切片技能才能將樣品切割到成像所需的滿足薄的厚度。
共聚集的光學切片功能答(dá)應用戶對厚安排成像而不需求特別的切片竅門。它還答應用戶對活的細胞(bāo)、安排以及生物體進行(háng)超高分辨率成像。活體細胞(bāo)成像現(xiàn)已變成共(gòng)焦顯微鏡的一個(gè)主要組成(chéng)部分。
這種光學切片的才能也意味著單張切片/圖畫能夠保存到計算機(jī),然後還(hái)能夠將圖畫重組為樣品的三維(wéi)圖畫。這(zhè)在現有的激光掃描體係中是非常主要的特征。
此體係在熒光成(chéng)像中會選用一些特別的光學元件。一個多見的(de)誤解以為激光器發生的激(jī)光輸出隻有一個波長(zhǎng)。實踐上簡直一切的激光器都將發生諧波或散射別的波長光。盡管這些次波段的光跟(gēn)主波段比較強度很弱,但(dàn)是他們仍是能夠大大降低信噪比。假(jiǎ)如熒光的發射波段恰好落在(zài)激光諧波的規模內(或(huò)是來自激光的別的(de)雜光),那麽熒光信號(hào)可能會(huì)徹底被掩蓋掉而勘探不到(dào)。
光路中的首要器件即是激光純化濾波片,這即是經修飾過的(de)激起光濾波片。因為激光(guāng)的相幹性和相對較小(xiǎo)的光束以及(jí)光路準直的請(qǐng)求,這些鏡片都是要通過(guò)研磨和拋光處理的。這就與寬(kuān)場顯微鏡構成明顯的對比,因為寬場顯微(wēi)鏡不需求(qiú)研磨和拋光。純化鏡片還應具有極好的傳輸特性,包(bāo)括波前(qián)畸(jī)變要少於每(měi)英寸一個波長。違背角(與鏡片外緣理想平行線的偏差)應盡量減小到小於一個弧(hú)度角(jiǎo)分,這麽在(zài)同一個體係中運用不一樣純(chún)化濾波片(piàn)的時分就不用從頭糾正(zhèng)了。
一個(gè)純化濾波片的半(bàn)波寬度(FWHM)通常是在10nm左右。它會堵塞激光光源的別的雜光(最大規模會從紫外光到(dào)1200nm)和減反射塗層來到達最大傳輸(shū)。
跟著更新、更強的(de)激光器的呈現,運用增透(tòu)膜來添加透過率就顯得沒有必要了。但是,這些光學器件選用最大反射的幹涉塗層以防止熱(rè)損害,增透(tòu)膜將因而削減表麵反射(shè)。這些反射(shè)光(guāng)不能被反射進入激光器的共(gòng)振腔。因而(ér),這些光件被規劃用(yòng)於入射角(AOI)在(zài)3.5度到5度之間。二極管激光器在熱身以後所發射的(de)光的(de)波長會有輕微(wēi)的變化,因(yīn)而,我們主張為這些光源裝備20-25nm寬的純化濾波片。在共聚集體係和(hé)一般熒(yíng)光(guāng)顯微體係中,為了獲得較好(hǎo)的平麵平整度,它們有必要(yào)克(kè)服波前(qián)像差。盡管兩種體係的波前(qián)像差都操控在(zài)每(měi)英寸(cùn)一個波的規模內(nèi),但在(zài)共聚集體係中挑選二向色鏡明顯能夠獲得更好的作用。
現在,要(yào)4-6m厚的熔融石英基片上完成二向(xiàng)色性現已很多見了(le),但不(bú)斷增加的(de)需求需求用更厚的基片來消除波前像(xiàng)差並完成二向色(sè)性(xìng)。
在(zài)過去幾年時刻裏,跟著(zhe)激光器的規模做得越來越大,也會有這些越來越大的功率負載可能會摧毀主鏡方麵的擔心。這關於規劃傑出的二向色鏡來說不成疑問,對多見大小的光(guāng)束負載最少到達8-10瓦特的功率。通過增透膜來最大極限的減小(xiǎo)聚束光的(de)反射使透射率最大化(huà)。
偏振也是濾鏡要思考的另一個因素。因為一切的光件對光(guāng)路有偏轉(zhuǎn)視點時都能夠充任偏振鏡,這對大多數偏(piān)振激光來(lái)說就顯得尤為主(zhǔ)要。
一切熒光發射濾鏡的主(zhǔ)要作用即是阻撓(náo)激起光的透過。比較(jiào)較於熒(yíng)光顯微鏡(jìng)而言(yán),關於共聚集(jí)體係,這種堵塞並不包括(kuò)很寬的(de)光譜規模(mó)。但是,因為激光束的高功(gōng)率輸出,需求對激光發(fā)射的特定波長專門規劃更大的堵塞(或許高於OD 8)。
對共聚集(jí)體係發射濾(lǜ)鏡的實(shí)踐規劃仍是(shì)存在一些爭議(yì)。因為(wéi)大多數勘探器選(xuǎn)用光電倍增管(PMT),圖畫(huà)一(yī)次采集隻(zhī)構成一個像素(圖畫元素),這些濾鏡光(guāng)件就不需求打磨和(hé)拋光。但因為共聚集成像對分辨率的(de)請求越來越高,就像別的發射濾波片相同通過打磨和拋光並不是在糟蹋精(jīng)力。近期一些(xiē)依據標明,發射濾波片具有(yǒu)較大楔形時(光束變差)可能會形成形態學丈量的不精確,這種(zhǒng)不精確在長發(fā)射(shè)光路中可(kě)能會更嚴峻。
激光體係的濾波片光具座(zuò)是(shì)環繞激光發射而規(guī)劃(huá)的,並不一(yī)定對於特定熒光染料的最大或激起。這(zhè)的確帶來有關的幾個疑(yí)問,什麽樣的(de)熒光染料才合適特定的激光體係。走運的是(shì),如今從(cóng)熒光染(rǎn)料的供應商那裏能夠獲得更多(duō)的挑選了(le)。別的也能夠挑選運用能夠便利和快速反射多個激光束的多色主鏡。